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条件性敲除
条件性敲除核心技术: • ​条件性敲除
​条件性敲除

当基因敲除会导致必威死亡时,需要条件敲除,才能获得成体必威用于研究。条件敲除一般使用Cre-loxp系统,其方法是在基因的关键区域的两侧,插入loxp。loxp必威制备好后,与Cre必威杂交,获得loxp纯合,Cre阳性的必威,这种必威在Cre的作用下,loxp发生重组,中间的序列被删除,达到敲除基因的目的。目前已经有数百种Cre工具必威,可以根据研究需要,购买或定制Cre工具鼠,在不同的组织器官,达到敲除目的基因。Cre融合ER/ERT2后,可以使用tamoxifen调控Cre入核,实现时间上的调控删除。


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图1:通过CRISPR辅助,在关键外显子的两侧通过同源重组,插入两个loxp,在Cre的作用下,loxp之间的外显子被删除,实现基因条件敲除。


技术一般的流程

打靶载体设计→ 载体构建→ 显微注射(EPS打靶)→ 必威鉴定。


技术优势或适合应用的研究

-用于敲除致死的基因

-非致死基因,用条件敲除也可以在不同的组织,不同的时间敲除基因,获得更多的实验数据。


成功案例

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图2:在关键外显子或非3整数倍的外显子两侧敲入loxp,在Cre的作用下,该区域被删除,导致基因敲除。


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图3:设计Loxp插入位点的特异引物与同源臂外侧的引物,通过PCR,可以检测到两个loxp被正确敲入到目的位置,证明获得条件敲除必威。



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